2. (a) डी० एन० ए० अनुक्रमण के विभिन्न तरीके क्या हैं? शॉटगन अनुक्रमण तरीके को विस्तृत कीजिए।

डीएनए अनुक्रमण के विभिन्न तरीके

डीएनए अनुक्रमण के कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिन्हें मोटे तौर पर दो मुख्य पीढ़ियों में बांटा जा सकता है: पहली पीढ़ी का अनुक्रमण और अगली पीढ़ी का अनुक्रमण (NGS)।

1. पहली पीढ़ी का अनुक्रमण

• सैंगर अनुक्रमण (Sanger Sequencing): इसे 'डाइडियोक्सी चेन टर्मिनेशन मेथड' भी कहते हैं। यह 1977 में फ्रेडरिक सैंगर द्वारा विकसित सबसे पुरानी और सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। यह विधि डीएनए प्रतिकृति की प्रक्रिया का उपयोग करती है और फ्लोरोसेंटली टैग किए गए डाइडियोक्सीन्यूक्लियोटाइड्स (ddNTPs) का उपयोग करके डीएनए संश्लेषण को रोकती है। यह कम लंबाई के डीएनए अनुक्रमों (100 से 1000 बेस पेयर) के लिए सटीक और विश्वसनीय है।
• मैक्सम-गिलबर्ट अनुक्रमण (Maxam-Gilbert Sequencing): यह विधि 1977 में एलन मैक्सम और वाल्टर गिलबर्ट द्वारा विकसित की गई थी। इसमें डीएनए को विशिष्ट क्षारों पर रासायनिक रूप से तोड़ना और फिर जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा खंडों को अलग करना शामिल है। यह जटिल और जहरीले रसायनों के उपयोग के कारण सैंगर विधि की तुलना में कम लोकप्रिय है।

2. अगली पीढ़ी का अनुक्रमण (Next-Generation Sequencing - NGS)

एनजीएस तकनीकों ने डीएनए अनुक्रमण के पैमाने, गति और लागत दक्षता में क्रांति ला दी है। ये विधियाँ एक साथ लाखों डीएनए खंडों का समानांतर अनुक्रमण करने की क्षमता रखती हैं। कुछ प्रमुख एनजीएस विधियाँ इस प्रकार हैं:

• इलुमिना अनुक्रमण (Illumina Sequencing): यह सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली एनजीएस विधि है। यह "अनुक्रमण द्वारा संश्लेषण" (Sequencing By Synthesis - SBS) सिद्धांत पर आधारित है, जहाँ फ्लोरोसेंटली टैग किए गए न्यूक्लियोटाइड को डीएनए स्ट्रैंड में शामिल किया जाता है और प्रत्येक समावेश पर एक छवि कैप्चर की जाती है। यह उच्च-थ्रूपुट और अत्यधिक सटीक डेटा प्रदान करता है।
• 454 पायरोसीक्वेंसिंग (454 Pyrosequencing): यह पायरोफॉस्फेट के रिलीज और बाद में ल्यूमिनेसेंस माप पर आधारित है जब एक न्यूक्लियोटाइड को डीएनए स्ट्रैंड में शामिल किया जाता है। हालांकि, यह अब व्यापक रूप से उपयोग में नहीं है।
• Ion Torrent अनुक्रमण (Ion Torrent Sequencing): यह न्यूक्लियोटाइड समावेश के दौरान जारी हाइड्रोजन आयनों का पता लगाकर काम करता है, जो पीएच परिवर्तन उत्पन्न करते हैं। यह एक अर्धचालक-आधारित विधि है।
• पैसिफिक बायोसाइंसेज (PacBio) अनुक्रमण: यह एक एकल अणु वास्तविक समय (Single Molecule Real-Time - SMRT) अनुक्रमण विधि है जो लंबे डीएनए अनुक्रमों को पढ़ सकती है (10,000 से अधिक बेस पेयर)। यह डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा डीएनए संश्लेषण की निगरानी करता है।
• ऑक्सफ़ोर्ड नैनोपोर अनुक्रमण (Oxford Nanopore Sequencing): यह एक पोर्टेबल और वास्तविक समय अनुक्रमण तकनीक है जो प्रोटीन नैनोपोर से गुजरने वाले डीएनए अणुओं द्वारा उत्पन्न विद्युत संकेतों में परिवर्तन को मापती है। यह बहुत लंबे अनुक्रमों को पढ़ सकता है।

शॉटगन अनुक्रमण विधि का विस्तृत विवरण

शॉटगन अनुक्रमण एक शक्तिशाली और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है, विशेष रूप से बड़े जीनोम (जैसे मानव जीनोम) को अनुक्रमित करने के लिए। इसे 'व्होल जीनोम शॉटगन सीक्वेंसिंग' भी कहा जाता है।

सिद्धांत:

शॉटगन अनुक्रमण का नाम शॉटगन से गोलीबारी के समान है, जहाँ लक्ष्य को बेतरतीब ढंग से छोटे टुकड़ों में तोड़ दिया जाता है। इस विधि में, संपूर्ण जीनोम को बेतरतीब ढंग से छोटे, अतिव्यापी (overlapping) डीएनए खंडों में तोड़ा जाता है। फिर इन प्रत्येक छोटे खंड को स्वतंत्र रूप से अनुक्रमित किया जाता है। अंत में, एक कंप्यूटर प्रोग्राम इन अतिव्यापी सिरों का उपयोग करके मूल, पूर्ण डीएनए अनुक्रम को फिर से जोड़ता है, जैसे कि एक पहेली को सुलझाना।

शॉटगन अनुक्रमण के चरण:

1. डीएनए का विखंडन (Fragmentation of DNA):
   • सबसे पहले, जीव के कुल जीनोमिक डीएनए को कई मिलियन छोटे, बेतरतीब ढंग से अतिव्यापी खंडों में तोड़ा जाता है।
   • यह यांत्रिक शीयरिंग (जैसे सोनिकेशियन) या प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग जैसे तरीकों से किया जा सकता है।
   • आमतौर पर, इन खंडों का आकार लगभग 2kb (किलोबेस) रखा जाता है।
2. लाइब्रेरी निर्माण (Library Construction):
   • खंडित डीएनए टुकड़ों को क्लोनिंग वैक्टर (जैसे प्लास्मिड या बैक्टीरियल आर्टिफिशियल क्रोमोसोम - BAC) में डाला जाता है।
   • ये क्लोनिंग वैक्टर डीएनए लाइगेज एंजाइम का उपयोग करके डीएनए खंडों के साथ जोड़े जाते हैं।
   • यह प्रक्रिया "डीएनए लाइब्रेरी" बनाती है, जिसमें जीव के जीनोम का प्रतिनिधित्व करने वाले कई डीएनए खंड होते हैं।
   • इस लाइब्रेरी को फिर ई. कोलाई जैसे जीवाणुओं में प्रविष्ट किया जाता है, जहाँ वे प्रतिकृति बनाते हैं।
3. अनुक्रमण (Sequencing):
   • लाइब्रेरी में प्रत्येक क्लोन किए गए डीएनए खंड को स्वतंत्र रूप से अनुक्रमित किया जाता है। पारंपरिक रूप से, इसके लिए सैंगर अनुक्रमण विधि का उपयोग किया जाता था, लेकिन अब अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्लेटफॉर्म, जैसे इलुमिना, का उपयोग अधिक सामान्य है।
   • प्रत्येक क्लोन से, केवल खंड के दोनों सिरों पर लगभग 500-800 बेस पेयर का "रीड" प्राप्त किया जाता है। लक्ष्य डीएनए के लिए कई अतिव्यापी रीड्स प्राप्त करने के लिए इस विखंडन और अनुक्रमण के कई राउंड किए जाते हैं।
4. अनुक्रम असेंबली (Sequence Assembly):
   • अनुक्रमण के बाद प्राप्त लाखों छोटे अनुक्रम रीड्स को एक कंप्यूटर प्रोग्राम में इनपुट किया जाता है।
   • यह प्रोग्राम विभिन्न रीड्स के अतिव्यापी सिरों की पहचान करता है और उनका उपयोग करके उन्हें एक सतत अनुक्रम में जोड़ता है।
   • यह प्रक्रिया "कॉन्टिग्स" (Contigs - सतत अनुक्रमित क्षेत्र) का निर्माण करती है, जो छोटे अतिव्यापी खंडों से बने बड़े डीएनए खंड होते हैं।
   • इन कॉन्टिग्स को आगे जोड़ा जा सकता है, जिससे पूरे जीनोम का पुनर्निर्माण होता है।
5. एनोटेशन (Annotation):
   • एक बार जीनोम अनुक्रम को इकट्ठा करने के बाद, कंप्यूटर प्रोग्राम जीनोम में जीन, नियामक तत्व और अन्य कार्यात्मक क्षेत्रों की पहचान करने के लिए उनका विश्लेषण करते हैं। इसे जीनोम एनोटेशन कहते हैं।

शॉटगन अनुक्रमण के लाभ:

• तेज और कुशल: यह बड़े जीनोम को अनुक्रमित करने का एक अपेक्षाकृत तेज और कुशल तरीका है, खासकर जब एनजीएस प्रौद्योगिकियों के साथ जोड़ा जाता है।
• सरलता: पारंपरिक 'क्लोन-बाय-क्लोन' अनुक्रमण की तुलना में इसमें कम प्रारंभिक मैपिंग की आवश्यकता होती है।
• लागत प्रभावी: बड़ी परियोजनाओं के लिए, यह अक्सर अन्य रणनीतियों की तुलना में अधिक लागत प्रभावी होता है।
• संपूर्ण जीनोम कवरेज: यह पूरे जीनोम का व्यापक कवरेज प्रदान कर सकता है।

शॉटगन अनुक्रमण की सीमाएं:

• पुनरावृत्ति अनुक्रम (Repetitive Sequences): दोहराए जाने वाले डीएनए अनुक्रमों वाले बड़े जीनोम को असेंबल करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि ओवरलैप की सही पहचान करना मुश्किल हो जाता है। मानव जीनोम का 50% से अधिक हिस्सा दोहराए जाने वाले डीएनए से बना है, जिससे असेंबली जटिल हो जाती है।
• कंप्यूटेशनल आवश्यकताएँ: बड़ी मात्रा में डेटा को संभालने और असेंबल करने के लिए महत्वपूर्ण कंप्यूटेशनल संसाधनों और परिष्कृत बायोइन्फॉर्मेटिक्स एल्गोरिदम की आवश्यकता होती है।
• गैप्स (Gaps): कुछ क्षेत्रों को कवर करने वाले रीड्स की कमी के कारण जीनोम में "गैप्स" रह सकते हैं, जिन्हें भरने के लिए अतिरिक्त अनुक्रमण की आवश्यकता हो सकती है।
• त्रुटियां: अनुक्रमण और असेंबली प्रक्रिया में त्रुटियां हो सकती हैं, विशेष रूप से दोहराए जाने वाले क्षेत्रों में।

आजकल, शॉटगन अनुक्रमण को अक्सर 'पियर्ड-एंड सीक्वेंसिंग' (Paired-end sequencing) या 'मेटेड-पेयर सीक्वेंसिंग' (Mate-pair sequencing) जैसी तकनीकों के साथ जोड़कर इसकी सटीकता और असेंबली क्षमताओं में सुधार किया जाता है।