पुनर्योगज डी.एन.ए. का निर्माण एवं इसके क्लोनन के चरणों का वर्णन कीजिए ।

पुनर्योगज डी.एन.ए. (rDNA) के निर्माण और उसके क्लोनन की प्रक्रिया में कई व्यवस्थित चरण शामिल होते हैं। यह तकनीक किसी जीव के जीनोम में वांछित जीन को प्रविष्ट कराकर नए गुणों वाले जीव का निर्माण करने में सक्षम बनाती है।

पुनर्योगज डी.एन.ए. का निर्माण (Construction of Recombinant DNA)

पुनर्योगज डी.एन.ए. का निर्माण एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें निम्नलिखित प्रमुख चरण शामिल हैं:

• 1. वांछित जीन की पहचान और पृथक्करण (Identification and Isolation of Desired Gene):
  • सबसे पहले, जिस विशिष्ट जीन को क्लोन करना है या किसी अन्य जीव में स्थानांतरित करना है, उसकी पहचान की जाती है।
  • इस जीन को युक्त डी.एन.ए. को स्रोत जीव से निष्कर्षित किया जाता है।
  • इसके बाद, प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएज (restriction endonuclease) एंजाइमों का उपयोग करके वांछित जीन को डी.एन.ए. के व्यापक खंड से काटा जाता है। इन एंजाइमों को "आणविक कैंची" भी कहा जाता है क्योंकि वे डी.एन.ए. को विशिष्ट स्थानों पर काटते हैं, जिससे "चिपचिपे सिरे" (sticky ends) बनते हैं जो अन्य डी.एन.ए. खंडों के साथ जुड़ सकते हैं। उदाहरण: EcoRI, HindII।
• 2. क्लोनिंग वाहक का चयन (Selection of Cloning Vector):
  • पृथक किए गए वांछित जीन को एक वाहक (vector) में डाला जाता है। वाहक एक डी.एन.ए. अणु होता है जो मेजबान कोशिका के भीतर स्वतंत्र रूप से प्रतिकृति बना सकता है और वांछित जीन को मेजबान कोशिका तक पहुँचाता है।
  • सबसे सामान्य वाहक प्लाज्मिड (जीवाणुओं में पाए जाने वाले छोटे, गोलाकार, दोहरे-स्ट्रैंड वाले डी.एन.ए. अणु) और जीवाणुभोजी (bacteriophages) होते हैं।
  • एक आदर्श वाहक में प्रतिकृति की उत्पत्ति (origin of replication), एक चयनात्मक मार्कर (selective marker, जैसे एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन) और कई प्रतिबंध स्थल होने चाहिए।
• 3. वाहक का प्रतिबंध एंजाइम द्वारा कटना (Digestion of Vector with Restriction Enzyme):
  • जिस प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग वांछित जीन को काटने के लिए किया गया था, उसी एंजाइम का उपयोग वाहक डी.एन.ए. (जैसे प्लाज्मिड) को भी काटने के लिए किया जाता है। यह सुनिश्चित करता है कि वाहक में भी ऐसे चिपचिपे सिरे उत्पन्न हों जो वांछित जीन के चिपचिपे सिरों के पूरक हों।
• 4. वांछित जीन का वाहक में निवेशन (Insertion of Desired Gene into Vector):
  • काटे गए वांछित जीन खंड को काटे गए वाहक डी.एन.ए. के साथ मिलाया जाता है। डी.एन.ए. लाइगेज (DNA ligase) नामक एंजाइम का उपयोग करके इन दोनों को आपस में जोड़ा जाता है। लाइगेज एंजाइम डी.एन.ए. खंडों के बीच फॉस्फोडिएस्टर बंध बनाकर उन्हें जोड़ता है।
  • इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप पुनर्योगज डी.एन.ए. (recombinant DNA) अणु का निर्माण होता है, जिसमें वांछित जीन वाहक के साथ एकीकृत हो जाता है।

पुनर्योगज डी.एन.ए. का क्लोनन (Cloning of Recombinant DNA)

पुनर्योगज डी.एन.ए. के निर्माण के बाद, इसकी कई प्रतियां बनाने के लिए क्लोनन की प्रक्रिया की जाती है। इसमें निम्नलिखित चरण शामिल हैं:

• 1. पुनर्योगज डी.एन.ए. का मेजबान कोशिका में स्थानांतरण (Introduction of Recombinant DNA into Host Cell):
  • पुनर्योगज डी.एन.ए. को एक उपयुक्त मेजबान कोशिका (host cell) में प्रवेश कराया जाता है, जो आमतौर पर जीवाणु (जैसे E. coli) या यीस्ट कोशिकाएं होती हैं।
  • इस प्रक्रिया को रूपांतरण (transformation), संक्रमण (transfection), या ट्रांसडक्शन (transduction) कहा जा सकता है, जो वाहक और मेजबान कोशिका के प्रकार पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, जीवाणुओं में, कैल्शियम क्लोराइड के साथ ऊष्मा उपचार (heat shock) या इलेक्ट्रोपोरेशन (electroporation) का उपयोग करके कोशिका झिल्ली को पुनर्योगज डी.एन.ए. के लिए पारगम्य बनाया जाता है।
• 2. रूपांतरित कोशिकाओं का चयन (Selection of Transformed Cells):
  • सभी मेजबान कोशिकाएं पुनर्योगज डी.एन.ए. को ग्रहण नहीं करती हैं। इसलिए, उन कोशिकाओं का चयन करना महत्वपूर्ण है जिनमें पुनर्योगज डी.एन.ए. सफलतापूर्वक प्रवेश कर चुका है।
  • इसके लिए वाहक में उपस्थित चयनात्मक मार्कर जीन (जैसे एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन) का उपयोग किया जाता है। जिन कोशिकाओं में प्लाज्मिड होता है, वे एंटीबायोटिक युक्त माध्यम पर जीवित रह सकती हैं, जबकि अन्य कोशिकाएं मर जाती हैं।
  • कुछ मामलों में, नीले-सफेद चयन (blue-white screening) जैसी विधियों का उपयोग करके उन कोशिकाओं की पहचान की जाती है जिनमें वांछित जीन वाला पुनर्योगज डी.एन.ए. होता है।
• 3. क्लोन का गुणन (Multiplication of Clones):
  • एक बार जब रूपांतरित और चयनित कोशिकाएं प्राप्त हो जाती हैं, तो उन्हें एक पोषक माध्यम पर उगाया जाता है।
  • मेजबान कोशिकाएं विभाजित होकर कॉलोनियां बनाती हैं, और प्रत्येक कोशिका विभाजन के साथ, पुनर्योगज डी.एन.ए. की भी प्रतिकृति होती है। इस प्रकार, वांछित डी.एन.ए. खंड की लाखों समान प्रतियां (क्लोन) प्राप्त होती हैं।
• 4. पुनर्योगज डी.एन.ए. की अभिव्यक्ति और उत्पाद का निष्कर्षण (Expression of Recombinant DNA and Product Extraction):
  • गुणा की गई कोशिकाओं से पुनर्योगज डी.एन.ए. को अलग किया जा सकता है।
  • यदि उद्देश्य किसी विशिष्ट प्रोटीन का उत्पादन करना है (जैसे इंसुलिन), तो मेजबान कोशिकाओं को वांछित जीन को अभिव्यक्त करने के लिए प्रेरित किया जाता है, जिससे प्रोटीन का उत्पादन होता है। इस प्रोटीन को फिर कोशिकाओं से निष्कर्षित और शुद्ध किया जाता है।

यह पूरी प्रक्रिया आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है, जिससे वैज्ञानिकों को जीवों के आनुवंशिक गुणों में हेरफेर करने और विभिन्न प्रकार के जैविक उत्पादों का उत्पादन करने में मदद मिलती है।