7. (b) प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के सिद्धान्त, यंत्रीकरण एवं अनुप्रयोगों की व्याख्या कीजिए।

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का सिद्धांत

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का सिद्धांत 'प्रतिदीप्ति' नामक एक भौतिक घटना पर आधारित है। जब कोई प्रतिदीप्तिशील पदार्थ (fluorophore) एक निश्चित तरंगदैर्ध्य के प्रकाश (उत्तेजना प्रकाश) को अवशोषित करता है, तो उसके इलेक्ट्रॉन उच्च ऊर्जा स्तर पर उत्तेजित हो जाते हैं। ये उत्तेजित इलेक्ट्रॉन तुरंत निचले ऊर्जा स्तरों पर लौटते हैं और इस प्रक्रिया में अवशोषित प्रकाश से अधिक लंबी तरंगदैर्ध्य का प्रकाश उत्सर्जित करते हैं। इस उत्सर्जित प्रकाश को 'प्रतिदीप्ति' कहते हैं।

• प्रकाश अवशोषण: प्रतिदीप्तिशील अणु एक विशिष्ट, कम तरंगदैर्ध्य वाले प्रकाश को अवशोषित करते हैं।
• ऊर्जा उत्तेजना: अवशोषित ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों को उच्च ऊर्जा अवस्था में उत्तेजित करती है।
• प्रकाश उत्सर्जन: इलेक्ट्रॉन अपनी मूल अवस्था में लौटते समय ऊर्जा को लंबी तरंगदैर्ध्य वाले प्रकाश के रूप में उत्सर्जित करते हैं। यह उत्सर्जित प्रकाश आमतौर पर उत्तेजना प्रकाश से कमजोर होता है।

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का यंत्रीकरण (संरचना)

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की मूल संरचना एक सामान्य प्रकाशीय सूक्ष्मदर्शी के समान होती है, लेकिन इसमें कुछ विशिष्ट सहायक उपकरण शामिल होते हैं जो प्रतिदीप्ति की घटना का लाभ उठाते हैं।

एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के मुख्य घटक:

• प्रकाश स्रोत (Light Source):
  • यह उच्च तीव्रता वाला प्रकाश उत्पन्न करता है, आमतौर पर पारा वाष्प लैंप (Mercury-vapor lamp), क्सीनन आर्क लैंप (Xenon arc lamp) या उच्च-शक्ति वाले LED और लेज़र का उपयोग किया जाता है।
  • यह विभिन्न तरंगदैर्ध्य के प्रकाश का उत्सर्जन करता है, जिसमें पराबैंगनी (UV) और नीला-बैंगनी प्रकाश शामिल हैं, जो प्रतिदीप्तिशील पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त होते हैं।
• उत्तेजना फ़िल्टर (Excitation Filter):
  • यह फ़िल्टर प्रकाश स्रोत से आने वाले प्रकाश की केवल एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य (उत्तेजना तरंगदैर्ध्य) को नमूने तक पहुंचने देता है और अन्य सभी अनावश्यक तरंगदैर्ध्य को अवरुद्ध करता है।
• द्विरंगी दर्पण या बीम स्प्लिटर (Dichroic Mirror or Beam Splitter):
  • यह एक विशेष प्रकार का दर्पण होता है जो उत्तेजना प्रकाश को नमूने की ओर परावर्तित करता है और नमूने से उत्सर्जित होने वाले लंबी तरंगदैर्ध्य के प्रतिदीप्ति प्रकाश को वस्तुनिष्ठ लेंस (objective lens) की ओर पारित होने देता है।
• वस्तुनिष्ठ लेंस (Objective Lens):
  • यह नमूने से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति प्रकाश को एकत्र करता है और उसे आवर्धित करता है।
• अवरोधक फ़िल्टर या उत्सर्जन फ़िल्टर (Barrier Filter or Emission Filter):
  • यह फ़िल्टर वस्तुनिष्ठ लेंस से आने वाले सभी अवशिष्ट उत्तेजना प्रकाश को अवरुद्ध करता है और केवल नमूने से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति प्रकाश को ऐपिस (eyepiece) या कैमरे तक पहुंचने देता है।
  • इसका उद्देश्य आंखों को उत्तेजना प्रकाश से होने वाले नुकसान से बचाना और एक स्पष्ट प्रतिदीप्ति छवि प्रदान करना है।
• ऐपिस या कैमरा (Eyepiece or Camera):
  • यह आवर्धित प्रतिदीप्ति छवि को देखने या रिकॉर्ड करने के लिए उपयोग किया जाता है।

कार्य प्रणाली:

1. प्रकाश स्रोत से प्रकाश उत्पन्न होता है।
2. यह प्रकाश उत्तेजना फ़िल्टर से गुजरता है, जो केवल आवश्यक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को चयनित करता है।
3. चयनित उत्तेजना प्रकाश द्विरंगी दर्पण द्वारा नमूने की ओर परावर्तित होता है।
4. नमूने में मौजूद प्रतिदीप्तिशील पदार्थ उत्तेजना प्रकाश को अवशोषित करते हैं और लंबी तरंगदैर्ध्य का प्रतिदीप्ति प्रकाश उत्सर्जित करते हैं।
5. यह प्रतिदीप्ति प्रकाश वस्तुनिष्ठ लेंस से गुजरता है।
6. वस्तुनिष्ठ लेंस से निकलने वाला प्रकाश द्विरंगी दर्पण से होकर गुजरता है, जो उत्तेजना प्रकाश को अवरुद्ध करता है और प्रतिदीप्ति प्रकाश को आगे बढ़ने देता है।
7. अवरोधक फ़िल्टर सुनिश्चित करता है कि केवल प्रतिदीप्ति प्रकाश ही ऐपिस या कैमरे तक पहुंचे, जिससे एक स्पष्ट प्रतिदीप्ति छवि बनती है।

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के अनुप्रयोग

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के जीव विज्ञान, चिकित्सा और अन्य वैज्ञानिक क्षेत्रों में व्यापक अनुप्रयोग हैं:

• कोशिका संरचना का अध्ययन:
  • कोशिकाओं के भीतर विशिष्ट संरचनाओं जैसे नाभिक, माइटोकॉन्ड्रिया, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और साइटोस्केलेटन को फ्लोरोसेंट डाई या प्रोटीन (जैसे GFP) का उपयोग करके लेबल और visualized किया जा सकता है।
• प्रोटीन स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति:
  • इम्यूनोफ्लोरेसेंस (Immunofluorescence) तकनीक का उपयोग करके, विशिष्ट प्रोटीन को एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट टैग करके कोशिका के भीतर उनके स्थान और अभिव्यक्ति के स्तर का अध्ययन किया जा सकता है।
  • यह जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिशीलता को समझने में मदद करता है।
• रोगजनक पहचान:
  • बैक्टीरिया, वायरस और अन्य रोगजनकों की पहचान के लिए इसका उपयोग किया जाता है, खासकर नैदानिक ​​माइक्रोबायोलॉजी में। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग करके विशिष्ट रोगजनकों को लक्षित किया जा सकता है।
• कोशिका व्यवहार का अध्ययन:
  • जीवित कोशिकाओं में कैल्शियम आयन एकाग्रता, pH स्तर और अन्य शारीरिक परिवर्तनों का मापन फ्लोरोसेंट सेंसर का उपयोग करके किया जा सकता है।
  • कोशिका व्यवहार जैसे कोशिका प्रवासन, कोशिका विभाजन और एपोप्टोसिस (Apoptosis) के अध्ययन में सहायक।
• आनुवंशिक अनुसंधान:
  • FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) तकनीक का उपयोग करके गुणसूत्रों पर विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों का पता लगाया जा सकता है।
  • जीन थेरेपी और आनुवंशिक रोगों के अध्ययन में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
• ड्रग डिस्कवरी:
  • नई दवाओं के विकास में, यह कोशिकाओं पर दवा के प्रभाव, रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन और दवा के अवशोषण की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है।
• ऊतक विश्लेषण:
  • कैंसर निदान और रोग विज्ञान में, ऊतक के नमूनों में रोगग्रस्त कोशिकाओं या विशिष्ट बायोमार्कर की पहचान के लिए इसका उपयोग किया जाता है।
• सामग्री विज्ञान:
  • कुछ बहुलक, सिरेमिक और अन्य सामग्री के आंतरिक दोषों या संरचनात्मक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए भी इसका उपयोग किया जा सकता है।